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抗體親和力成熟的策略總結

2017-06-07 來源:admin

目前,药用抗体的研发主要基于杂交瘤细胞或者体外抗体库。通过抗原设计和抗体筛选,人们初步获得阳性的hits,再进一步通过一系列生物性质检测和功能验证,最终得到有药用潜力的抗体。在实际研发过程中,经过了常规筛选所得的抗体,有诸多方面需要更细致的改进,包括亲和力、免疫原性、半衰期等等,抗体领域这些年来做了很多相关的研究和实践。其中,抗体亲和力成熟是研究的重要方向之一。理论上,抗体亲和力的提高有助于改善抗体的特异性和效力,有助于减少用药剂量,降低毒副作用等。虽然实际的研究工作证明亲和力的提高与抗体效价的提高并不总是线性的关系,尤其在实体瘤的治疗上(可参考Weinstein的“binding site barrier”假说[1]),但很多情况下,这个线性关系是明显存在的。另外,发展抗体亲和力成熟的技术,不仅有助于抗体药物的研发和质量改善,同时也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理,更好地认识靶点的功能。


本文中,小編就與大家分享自己對抗體親和力成熟技術的簡單總結。本文涉及的技術內容整理如下,之後的行文將圍繞這個提綱展開:


1. 模拟体细胞高频突变的抗体亲和力成熟策略

BCR基因重排後的成熟B細胞受到抗原刺激後,會于生發中心發生重鏈和輕鏈V區的高頻率突變(主要是點突變),之後再經過FDC捕獲抗原使表達高親和力BCR的B細胞免于凋亡。這一過程使得後代B細胞的BCR對抗原的平均親和力得到提升。這樣的體細胞高頻突變屬于二次免疫應答,幫助可有效識別抗原的抗體進一步成熟,有助于機體有效抵抗外來抗原的再次入侵。


抗體親和力成熟的策略之一,就是模擬體細胞高頻突變,通過細胞突變和展示抗體蛋白篩選對抗原高親和的抗體。


1.1 基于B细胞系(人、鸡等)高频突变的筛选策略

Ramos是來源于人Burkitt淋巴瘤的一株細胞系,在培養過程中其重排後的免疫球蛋白V區基因持續發生組成型突變,並表達到膜表面。早在2002年Sarah等人就報道了利用Ramos細胞系篩選出對鏈黴親和素有高親和力的IgM[2]。他們將鏈黴親和素結合到磁珠上,從一群Ramos細胞中篩出對鏈黴親和素有低親和力的細胞群,之後降低磁珠上的鏈黴親和素的密度以提高篩選的苛刻程度,進一步篩出親和力更高的突變。之後又進一步用標記FITC熒光的鏈黴親和素結合流式分選將抗體親和力進一步提高。


隨後,他們對各批次的亞克隆細胞的V區基因做了序列比對,找出了突變位點,分析了抗體與靶點之間的構效關系:


同在這篇文章中,他們還嘗試了使用XRCC2缺失的雞來源的B細胞系(DT40),篩選針對多個抗原的高親和力IgM。該細胞系同樣具有高頻率的V區基因組成型突變,並且比Ramos細胞系增殖時間更短。篩選結果顯示該細胞系也能實現IgM的親和力成熟。


以上两个例子说明合适的B细胞系可以作为工具细胞,用于抗体的亲和力成熟。在具体应用中,可以将特定的抗体模板基因插到细胞的免疫球蛋白基因位点,然后进行细胞培养和高亲和力细胞群的筛选。但基于体细胞高频突变的抗体亲和力成熟技术有一定的缺陷,至少包括两点:一是体细胞高频突变过程中每个密码子中通常只有一个碱基发生突变,这严重制约了突变后的库的多样性;二是由于快速的内部化效应,BCR的亲和力往往会遇到天花板(KD值很难达到0.1 nM以下)。


1.2 基于其他细胞高频突变的策略研究

基于體細胞高頻突變的抗體親和力成熟的開發,主流方法均是基于B細胞系。B細胞系有其自身的不足,如基因操作比較困難、蛋白的翻譯後修飾特點不能滿足所有外源蛋白的要求等等。于是有實驗室嘗試在非B細胞系統上實現親和篩選,以擴充該技術的細胞系選擇面。如中科院生物物理所杭海英課題組,向人非小細胞肺癌細胞系H1299中導入激活誘導的胞苷脫氨酶(AID),構建H1299-AID穩轉株,然後進一步導入抗TNF-α的scFv基因並構建穩轉株,得到的穩轉株進行培養和流式分選,獲取高親和力的scFv[3]。


除此之外,还有基于非真核系统的筛选方法,如利用E. Coli的基因增变株来实现抗体基因的高频突变等等,其原理大同小异。


2. 基于抗体库的亲和力成熟策略

基于抗體庫的抗體親和力成熟與基于抗體庫的抗體篩選並無本質差別,均爲體外高親和力抗體篩選,重點仍是兩個方面,即庫的構建和篩選系統的選擇。區別在于,後者所用的庫在構建或合成時無偏向性或只具有針對某抗原的有限的偏向性;而前者所用的庫是基于確定的抗體序列模板所構建的。


2.1 建库策略

建庫的策略可分爲兩個大的類別:一類是構建較大的庫,將抗體CDR區域甚至整個V區做隨機突變;另一類是構建較小的庫,將突變集中于抗體序列上特定的區域。


大库构建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段随机突变并保证相邻两个突变区域有所重叠,从而使突变覆盖整个CDR区域;chain shuffling是将抗体的VH和VL的配对重新洗牌,而DNA shuffling则是将抗体V区的序列重新洗牌。在DNA shuffling中,突变不限于CDR区,也包括FR区域,因为FR区域对于抗体与抗原的结合也可能有所贡献。这些方法所构建的库的容量较大,工作量也较大。


相比大庫的構建,小庫構建更有序列針對性。在沒有其他信息的情況下,人們習慣優先選擇對抗體重鏈CDR3區域進行隨機突變,因爲重鏈CDR3區域被認爲通常對抗原抗體結合起關鍵作用;但若要真正提高親和力優化的效率,還需要更多的信息以幫助人們找出更精確的突變區域。


目前突变区域的选择主要是基于抗原抗体复合物的结构信息或胚系基因热点(germline hotspots)的预测。


1)基于抗原抗體複合物的結構信息的突變區域選擇

當抗體抗原複合物的結構被解析之後,我們就可以得知兩者相互作用的位點信息,進而進行更精確的突變和建庫。


MorphoSys AG2016年发的文章[4]介绍了他们提高其自身的抗人GM-CSF抗体MOR103的亲和力的工作。他们在知悉该抗体与抗原的结合方式后,对抗体的CDR-H2和CDR-L3分别做随机突变,并用噬菌体展示的方法筛选到高亲和力的序列,之后再把筛到的重链与轻链配对,得到一个新的“cross-cloned”抗体:


體外GM-CSF和GM-CSFR結合的抑制實驗比較了這4個抗體的效價。另外,他們還分別解析了這4個抗體與GM-CSF結合的複合物的結構並進行比較,探討了構效關系。


2)基于胚系基因热点(germline hotspots)的突变区域选择

Germline hotspots是体细胞高频突变过程中的优先突变区域,几乎都处于CDR区域内部,经证明对抗体的亲和力提高起到关键作用,因此体外亲和力成熟时可优先考虑抗体的germline hotspots。


具体的做法是利用数据库来比对抗体的序列和抗体胚系基因序列,结合序列相似度和RGYW motifs等坐标性的序列预测出germline hotspots,然后在这些热点位置进行突变,构建小的库进行筛选。早在2009年,Ira Pastan课题组就发表protocol,以抗CD22的单抗为例,利用germline hotspots预测和噬菌体展示技术提高抗体的亲和力[5]。


至于引入突變的方法,較簡單的是易錯PCR,但很難達到好的突變效果。另外一種比較流行的就是在引物上設計突變,即人工合成帶有突變區域的引物庫。具體的設計方法有很多,包括控制突變堿基的數目、控制每個位點各種堿基出現的概率等,以此來滿足對庫的容量和偏向性的需求。


2.2 筛选方法

基于庫的抗體親和力成熟與基于庫的抗體初步篩選涉及的方法基本相同,主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統。


噬菌體展示的優勢在于操作方便,流程相對簡易;酵母展示的優勢在于與流式分選相結合,檢測和篩選同時進行;核糖體展示的優勢是系統容量較大,可用于大庫的篩選,另外可以實現庫的體外進化。這些技術各有優劣,根據實際需要選擇使用。


參考文獻


  • Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: direct experimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research

  • Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology

  • Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFvwith somatic hypermutation in non-B cells. Protein Cell

  • Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolution of a neutralizing anti-human GM-CSF antibody. mAbs

  • In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. Methods MolBiol


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